L’obiettivo generale del progetto è lo sviluppo di sistemi di produzione di oli di oliva da agricoltura biologica economici e competitivi, sostenibili, sicuri, tracciabili e di alta qualità, attraverso la comprensione ed il miglioramento della gestione dell’ecosistema, il mantenimento e la valorizzazione della biodiversità dell’olivo e dell’attività biologica dei suoli, l’adozione di nuove tecniche analitiche di monitoraggio dei residui di fitofarmaci permessi e non in agricoltura biologica ed il miglioramento della qualità nutrizionale e sensoriale dell’olio di oliva prodotto. Glio biettivi della ricerca per l’intera durata del progetto sono stati i seguenti:
1) Ottimizzazione di protocolli di estrazione ed analisi mediante PCR del DNA da oli di oliva extravergine e raffinati.
2) Sviluppo di marcatori SCAR di olivo cultivar-specifici derivati da frammenti AFLP.
3) Selezione e valutazione di primer SSR da loci micro satellitari di olivo.
4) Disegno di sonde Taqman e/o molecular e PNA beacon su frammenti genomici cv-specifici per allestimento di esperimenti PCR e Real-Time PCR (PCR quantitativa).
5) Determinazione della presenza e contenuto percentuale di oli di specie diverse dall’olivo (p.e. nocciola, mais, girasole, soia).
6) Valutazione della sensibilità e riproducibilità di sistemi diagnostici, basati su Real Time PCR e su tecniche che utilizzano sonde a PNA,su miscele di DNA da materiale vegetale proveniente da diverse cultivar.
7) Progettazione e sintesi di PNA fluorescenti e PNA beacon per la rivelazione di OGM.
8) Sviluppo di metodi di CE e micro-CE, HPLC e micro-HPLC per la rilevazione di micro-quantità di DNA nella matrice oleosa.
Sintesi dei risultati:
1) E’ stato messo a punto un protocollo per l’estrazione di DNA in quantità e qualità elevate da oli extravergine di oliva ed adatto per successivi impieghi di tracciabilità. Il metodo sarà oggetto di brevetto e/o di pubblicazione;
2) In olivo sono stati identificati a livello di DNA nucleare marcatori molecolari di tipo SNP (single nucleotide polymorphism) e SSR (simple sequenze repeat) cultivar specifici ed adatti per differenziazione di cultivar di olivo e per risalire all’origine delle cultivar che hanno dato origine agli oli extra vergine di oliva. La ricerca ha prodotto una pubblicazione ed altre sono in preparazione.
3) In olivo è stato sequenziato il plastoma e sonos tati individuati nel corrispondente DNA marcatori molecolari SNP e SSR cultivar specifici particolarmente idonei per il riconoscimento varietale e perla tracciabilità degli oli. I risultati conseguiti sono oggetto di brevetto e/odi pubblicazione.
L’impiego dei sopraccitati marcatori molecolari cultivar specifici ha consentito il disegno di PNA e PNA-beacon ideali per la caratterizzazione varietale e per svelare la presenza nell’olio extra vergine di oliva di tracce di oli di altre specie vegetali (mais, nocciola, soia etc), nonché per la rintracciabilità delle varietà da cui sono stati estratti gli oli commerciali. Le sonde a PNA trovano applicazione nella tecnologia microarrays e le sonde a PNA-beacon in sistemi HPLC a scambio anionico di tipo high tech. Infatti la tecnologia HPLC-IE è risultata in grado di discriminare mutazioni puntiformi nel rapporto di 80-100:1 con una sensibilità limite di 2nMe cioè di 20 fmoli di DNA iniettato. I risultati conseguiti sono in corso di presentazione a gruppi industriali per verificarne l’interesse all’acquisto di un eventuale brevetto; inoltre parte dei risultati sarà oggetto di pubblicazione su riviste internazionali
