L’obiettivo generale del progetto è lo sviluppo di sistemi di produzione di oli di oliva da agricoltura biologica economici e competitivi, sostenibili, sicuri, tracciabili e di alta qualità, attraverso la comprensione ed il miglioramento della gestione dell’ecosistema, il mantenimento e la valorizzazione della biodiversità dell’olivo e dell’attività biologica dei suoli, l’adozione di nuove tecniche analitiche di monitoraggio dei residui di fitofarmaci permessi e non in agricoltura biologica ed il miglioramento della qualità nutrizionale e sensoriale dell’olio di oliva prodotto. <br /><br /><br />Dimetoato<br /> <br />Introdotto nel 1956, è un insetticida sistemico destinato, come tutti i fosforganici, ad essere bandito dall’Unione Europea. Agisce per contatto e per ingestione ed è indicato per la lotta contro insetti ad apparato boccale succhiatore e contro ditteri, tra cui, in particolare, la mosca delle olive, la mosca della frutta, la tignola delle olive ed altri insetti su diverse colture.<br /> <br />Il dimetoato è caratterizzato da un’elevata azione citotropica, per cui penetra con facilità nell’interno dei tessuti vegetali trattati (mesocarpo dei frutti, mesofillo delle foglie, ecc.), e si trasferisce entro certi limiti, per via sistemica, anche nei tessuti non trattati, compensando così, in breve tempo, eventuali deficienze di deposito insetticida. Se da un lato si possono così combattere anche fitofagi che sono in posizione riparata, quali larve minatrici di ditteri, lepidotteri e larve endocarpiche, dall’altro, però, l’impatto del dimetoato sull’entomofauna dell’oliveto è notevole e preoccupante (Iannotta et al.,2008).<br /> <br />Il dimetoato si trova in commercio sotto forma di concentrato emulsionabile o come formulazione in polvere. Il metabolismo del dimetoato negli organismi vegetali ed animali procede in maniera relativamente rapida attraverso reazioni di ossidazione ed idrolisi, per dare una varietà di prodotti, dei quali solo l’analogo ossigenato, l’ometoato, è caratterizzato da una tossicità acuta più elevata del dimetoato, corrispondente a DL50orale pari a 55 mg/Kg nei ratti bianchi (in confronto ad un valore di 500-600 mg/Kg per il dimetoato).<br /> <br />Al fine di sviluppare un nuovo metodo analitico per la determinazione del dimetoato nelle olive e negli oli d’oliva mediane MS è stato sintetizzato il dimetoato-d3, cioè, l’isomero trideuterato, che è stato utilizzato come standard interno in esperimenti di diluizione isotopica. La metodica è stata sviluppata sia mediante uno strumento GC/MS ion trap, che uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo (API 2000) con sorgente “ionspray” mediante esperimenti di spettrometria di massa tandem (ISI/MS/MS). Lo studio degli schemi di frammentazione delle due molecole, ipotizzati in base ai picchi di massa acquisiti mediante i suddetti spettrometri, ha permesso la scelta delle condizioni operative più idonee per l’applicazione del metodo della diluizione isotopica, combinato con la spettrometria di massa, alla determinazione quantitativa del dimetoato. I risultati di tale ricerca sono stati oggetto di una Tesi sperimentale presso il Dipartimento di Chimica della Università della Calabria.<br /> <br /> <br /> <br />Rotenone<br /> <br />L’interesse e l’esigenza dei consumatori verso la salubrità degli alimenti ha indotto il Ministero della Salute a considerare prioritario il raggiungimento di più elevati standard di sicurezza alimentare. La sensibilità alle problematiche salutistiche ha portato nel comparto oleario ad un incremento del consumo di olio proveniente da conduzione dell’oliveto secondo il metodo dell’agricoltura biologica. I consumatori, infatti, ritengono tali oli d’oliva, non solo ottenuti con sistemi di produzione rispettosi per l’ambiente, ma anche privi di residui di fitofarmaci e di pesticidi, in particolare. <br /> <br />Il Rotenone è un pesticida naturale, contemplato dall’allegato II B del Reg. CEE 2092/91 ed estratto dalle radici di alcune piante leguminose del genere Derris, Tephrosia eLonghocharpus. É utilizzato come veleno per i pesci e come insetticida non selettivo su una grande varietà di piante. É considerato moderatamente tossico per gli uomini4 visto che la dose letale stimata si attesta tra i 300 ed i 500 mg/Kg. Il rotenone è un inibitore del complesso I della catena respiratoria mitocondriale. Dalla letteratura risulta che tale prodotto induce, su animali da laboratorio, stress ossidativo dovuto all’accumulo di ROS a livello mitocondriale delle cellule neuronali e successiva perdita dei terminali dopaminergici nigrostriatali della substantia nigra pars compacta. In un esperimento su cavie, ha provocato l’insorgenza di sintomi analoghi a quelli dovuti al morbo di Parkinson. Il rotenone è stato fino ad oggi ampiamente usato nella difesa dell’olivo per la produzione di oli di oliva da agricoltura biologica, anche se, in generale, si degrada più lentamente nelle olive che in altri vegetali. Il limite massimo fissato dalla legislazione Italiana nelle olive è di 0.04 mg/Kg.<br /> <br />Il 10 aprile 2008, la Commissione Europea ha deciso la non iscrizione del rotenone nell’allegato I della direttiva 91/414/CEE del Consiglio e la revoca delle autorizzazioni di prodotti fitosanitari contenenti tale sostanza, ipotecando in modo definitivo una nuova iscrizione del rotenone tra i principi attivi ammessi dal nuovo regolamento sull’agricoltura biologica.<br /> <br />Nei tre anni e mezzo di ricerche del progetto OLIBIO, la spettrometria di massa Elettrospray ionisation (ESI) o Ionspray (ISI) è stata utilizzata per studiare la frammentazione del rotenone e di alcune molecole derivate e per mettere a punto un metodo di quantificazione basato sul monitoraggio di una transizione con la tecnica del Multiple reaction monitoring (MRM). Come standard interno è stato utilizzato un cicloaddotto ottenuto mediante sintesi che presenta lo ione comune m/z192 nello spettro MS/MS.<br /> <br />Si è ritenuto opportuno verificare, ai fini della sicurezza alimentare delle olive e dell’olio, la presenza di residui di tale prodotto soprattutto al fine di meglio valutarne i tempi di carenza o sicurezza. Pertanto, sono stati messi a punto due nuovi metodi analitici innovativi per la determinazione del rotenone e del dimetoato nelle olive e negli oli di oliva, mediante Spettrometria di massa, più sensibili, selettivi e specifici dei metodi tradizionali.<br /> <br />L’applicazione di tali metodi in tre anni di sperimentazione in areali diversi e su differenti cv, ha permesso di dimostrare, ad esempio, che il contenuto di rotenone nelle drupe rientra nei limiti di legge (<50 ppb) solo a distanza di circa 20 giorni dal trattamento, mentre nell’olio d’oliva il contenuto di rotenone è più elevato che nelle drupe corrispondenti e che occorrono mediamente almeno 25 giorni affinché tale contenuto scenda sotto i limiti di legge, previsti per le sole drupe. <br /> <br />Nei primi due anni di sperimentazione, sono stati effettuati trattamenti con un prodotto commerciale a base di rotenone su oliveti, rispettivamente, in agro di Palermiti (CZ) e Strongoli (KR). Nel terzo anno il trattamento è stato effettuato su giovani piante di olivo appartenenti alle cultivar Cassanese e Nocellara del Belice presso il campo sperimentale di Rende (CS). In tutti e tre i casi, sono stati effettuati monitoraggi per valutare il grado di infestazione da Bactrocera Oleae. Il trattamento veniva effettuato al raggiungimento della soglia di infestazione programmata (15% di punture fertili). Ogni dieci giorni sono stati effettuati prelievi ed analisi chimiche sul frutto e sull’olio. Le metodiche analitiche hanno previsto l’utilizzo di uno spettrometro di massa API 2000 nella configurazione APCI-MS/MS (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – Tandem Mass Spectrometry). La determinazione quantitativa era basata sull’utilizzo di uno standard interno ottenuto per sintesi (M. Cordaro et al., 2004; L. Di Donna et al., 2004). <br /> <br />Secondo la normativa vigente, le drupe da produzione biologica dovrebbero contenere una quantità di rotenone che non superi i 50 ppb e, questo limite dovrebbe essere raggiunto 20 giorni dopo il trattamento della pianta, secondo quanto stabilito dalle ditte fornitrici. Si può ipotizzare che l’imprevedibilità delle condizioni climatiche possano influenzare in qualche modo il meccanismo di degradazione del rotenone dalle piante trattate e questo spiegherebbe perché, esso, decada rapidamente nei primi 10 giorni successivi al trattamento, per poi regredire più lentamente nei successivi. La differenza nel diverso contenuto di principio attivo tra drupe ed olio, seppure appartenenti alla stessa epoca di raccolta ed al medesimo campione di frutti, è dovuta sicuramente alla maggiore lipofilicità del rotenone.<br />È possibile notare che in tali esperimenti il limite dei 50 ppb nelle drupe è stato raggiunto, in media, dopo 20 giorni dal trattamento, periodo, però, non sufficientemente lungo da consentire una riduzione di concentrazione nell’olio d’oliva. Considerata la dannosità della molecola per la salute umana, e il contenuto elevato riscontrato negli oli analizzati, occorrerebbe riconsiderare le metodiche analitiche e i valori dei limiti massimi dei residui ammessi. Tutto ciò contribuisce a rendere inutile l’utilizzo stesso del rotenone nella difesa fitosanitaria in olivicoltura biologica.<br /><br /><br /><br /><br />Teresa Casacchia, Adriano Sofo, Pietro Toscano, Luca Sebastianelli, Enzo Perri 2009. Persistence and effects of rotenone on oil quality in two Italian olive cultivars, Food and Chemical Toxicology 47, 214–219.<br />Massimiliano Cordaro, Leonardo Di Donna, Giovanni Grassi, Loredana Maiuolo Fabio Mazzotti, Enzo Perri Giovanni Sindona and Antonio Tagarelli, 2004, High resolution Electrospray and Electrospray Tandem mass spectra of Rotenone and its Isoxazoline Cycloadducts., Eur. J. Mass Spectrom, 10, 691-697.<br />Leonardo Di Donna, Giovanni Grassi, Fabio Mazzotti, Enzo Perri and Giovanni Sindona, 2004, High-throughput Assay of rotenone in olive oil using Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Tandem Mass Spectrometry. J. Mass Spectrometry, 39: 1437-1440.<br />Leonardo Di Donna; Barbara Macchione; Fabio Mazzotti; Enzo Perri; Giovanni Sindona, 2008, Quantitative assay of dimethoate in foods by liquid chromatography tandem mass spectrometry and isotope dilution, 56th ASMS Conference on Mass Spectrometry, Denver, Colorado, Abstract n. 1867.<br /><br /><br />
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